于2015年诞生的二楼南书房对于南京来说有着非同寻常的意义，它是南京首家24小时开放的公共阅读空间。如今，二楼南书房已在南京拥有了不少家衍生连锁书房，如百家书房、江东书房、江宁图书馆市民中心分馆等。

二楼南书房藏身于新街口一处民国建筑内，这里曾是民国时期上将刘峙的居所。书房为一栋带有庭院的二层房屋，一楼不开放，从楼梯处拾级而上即可抵达书房，这也是书房命名的由来。二楼南书房的装修风格受到选址影响，民国气息浓厚，老铜壁灯、深蓝绣花桌布、竹编靠椅、雕花木窗等设计元素随处可见，颇为古色古香。

书房体量不大，由三间房间组成，面积约60平米。书房的阅读位不到20个，人多时便稍显拥挤，降低了阅读体验感。二楼南书房的藏书量不多，只有3000余册，不过图书的涉及面并不窄束，包括文学、历史、政治、美学、设计、艺术等不同类别。

图书均根据出版社分类，这些出版社大多是业界代表，如中华书局、上海译文出版社、生活·读书·新知三联书店等。二楼南书房并未对图书细分，不同类型的图书混杂于一起，再加上书房未设图书检索系统，因此不方便读者找书。在筛选图书方面，二楼南书房主要依据豆瓣评分、亚马逊星级标准。二楼南书房并非一味地选择畅销书或追求小众，而是更看重图书的经典型，以文学类为例，多是加西亚·马尔克斯、米兰·昆德拉等经典作家的著作。

作为一家24小时书房，二楼南书房为过夜的读者提供免费饮用水与付费饮品，如咖啡、茶等，价格适中。书房备有阅读灯、热水壶与纸巾，并设有洗手间。

与南京大部分书店相比，二楼南书房所举行的线下活动不多，且由于场地限制，书店活动多为小型讲座，形式单一。二楼南书房及其衍生连锁书店的活动各有不同，读者在书店公众号内报名参与活动。二楼南书房不出售图书，书店内的图书皆可免费阅读，若需要借阅图书，则需要办理会员卡，并交纳押金，金额通常为百元左右，具体信息以官方为准。